琼脂糖凝胶电泳DNA回收实验方法和注意事项

琼脂糖凝胶电泳DNA回收实验方法和注意事项 | 时间: May-15 17:00:14 | 分类:技术栏目

实验前准备及重要注意事项

1．第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明在Buffer PW中加入无水乙醇。

2．使用前请检查Buffer PG，如果出现结晶或者沉淀，可在37℃水浴中放置3-5分钟，即可恢复澄清。

3．电泳时较好使用新的电泳缓冲液，避免影响电泳和回收效果；如下一步实验要求较高，请尽量使用TAE电泳缓冲液。

4．切胶时，紫外照射时间应尽量短，以免对DNA造成损伤。

5．回收率与初始DNA量和洗脱体积有关，初始量越少，洗脱体积越少，回收率越低。

6．将水浴锅预热至50℃。

7．Buffer PG中含有pH指示剂，当pH≤7.5时溶液的颜色为黄色，此时DNA才能够有效的与膜结合，当pH值偏高时溶液的颜色变为桔红色和紫色，需要进行调整。

8．所有离心步骤均可室温下

操作步骤

1．将单一目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分），放入干净的离心管（自备）中，称量计算凝胶重量（提前记录离心管重量）。注意：若胶块的体积过大，可将胶块切成碎块。

2．向胶块中加入1倍体积Buffer PG（如凝胶重为100 mg，其体积可视为100 μl，依此类推）。

3．50℃水浴温育，其间每隔2-3分钟温和地上下颠倒离心管，待溶胶液为黄色，以确保胶块充分溶解。如果还有未溶的胶块，可再补加一些溶胶液或继续放置几分钟直至胶块完全溶解。

注意：1）凝胶完全融解后胶溶液为黄色，可进行后续操作；若胶溶液为桔红色或紫色，可向胶溶液中加10-30 μl 的3 M醋酸钠（pH 5.0），将溶液的颜色调为黄色后再进行后续操作。

2）胶块完全溶解后较好将胶溶液温度降至室温再上柱，吸附柱在较高温度时结合DNA的能力较弱。

4．（可选步骤）当回收片段<300 bp时，应加入1/2胶体积的异丙醇，上下颠倒混匀（如凝胶重100 mg，则加入50 μl的异丙醇）。

5．柱平衡：向已装入收集管中的吸附柱（Spin Columns DM）中加入200 μl Buffer PS，13,000 rpm（~16,200×g）离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

6．将步骤3或4所得溶液加入到已装入收集管的吸附柱中，室温放置2分钟，13,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。注意：吸附柱容积为750 μl，若样品体积大于750 μl 可分批加入。

7．向吸附柱中加入450 μl Buffer PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），13,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。注意：如果纯化的DNA用于盐敏感的实验（例如平末端连接或直接测序），建议加入Buffer PW

静置2-5分钟再离心。

8．重复步骤7。

9．13,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液。注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇的残留会影响后续的酶促反应（酶切、PCR等）。10．将吸附柱放到一个新的1.5 ml离心管（自备）中，向吸附膜中间位置悬空滴加50 μl

Buffer EB，室温放置2分钟。13,000 rpm离心1分钟，收集DNA溶液。-20℃保．DNA。

注意：1）为了提高DNA的回收量，可将离心得到的溶液重新滴加到吸附柱中，室温放置2分钟，13,000 rpm离心1分钟。

2）洗脱体积不应小于30 μl，体积过少会影响回收效率。

3）回收大于10 kb的DNA片段时，Buffer EB应在50℃水浴中预热，可增加回收效率。

备注：本试剂盒也适用于PCR产物的纯化回收。在PCR反应液中加入等体积的BufferPG，充分混匀（对于回收小于150bp的小片段可将溶液的体积增加到3倍以提高回收率）接上述步骤5进行后续操作。